Le Professeur Behar était à Toulouse le 17 mai

Le texte n’est pas facile mais capital….Maître de conférence honoraire de Biophysique à l’Université Paris VI et Médecin honoraire des hôpitaux de Paris spécialisé en médecine nucléaire, le docteur Abraham Béhar a été directeur du laboratoire de radiobiologie/ micro circulation de l’Université Paris VI. Il a aussi été le président de l’association internationale « International Physicians for the Prevention of Nuclear War » (IPPNW), qui reçu le prix Nobel de la paix en 1985. Il est maintenant président de l’Association des médecins français pour la prévention de la guerre nucléaire (AMFPGN).

LA RADIOBIOLOGIE A CHANGE DE BASE :
LES EFFETS A LONG TERME DES RAYONNEMENTS REVISITES.

La radiobiologie reste par définition la science du transfert d’énergie des rayonnements ionisants vers les tissus vivants. A l’échelle cellulaire, ce transfert peut être direct, comme pour toute absorption des rayons par la matière ou indirect par les produits de la radiolyse du cytoplasme, appelés « radicaux libres ».

LES EFFETS CIBLES :

Ils sont une étape obligatoire de la radiobiologie et concernent l’ADN, l’ARN et les protéines dans la cellule. Depuis les découvertes de LATARJET en 1940, on a fortement privilégié les lésions des noyaux, et singulièrement les lésions des chromosomes. Des générations d’étudiants en médecine ont eu droit à la saga des ruptures d’ADN, simple ou double brins, et à la théorie des n cibles à n coups. Très vite, les radio biologistes ont compris que la réparation des dommages créés par le dépôt d’énergie des rayons n’était pas complète, et dans le cas inverse, la non-réparation n’induisait pas forcement la mort programmée de la cellule (c’est à dire l’apoptose). Même si pendant longtemps le seul test disponible consistait à mesurer le taux de survie d’une population de cellules irradiées, nous savions que les cellules fautives, mal réparées, pouvaient se diviser et transmettre des aberrations chromosomiques.
En tout état de cause, la caractéristique fondamentale des effets ciblés, c’est à dire la relation dose / effet n’a jamais été remise en cause. Il était donc de ce fait possible de mesurer directement sur le tissus vivant la quantité d’énergie absorbée par les noyaux cellulaires. La référence peut donc rester physique, l’unité d’énergie absorbée appelée « dose » s’exprime alors en Joule/kg, et porte le nom de « Gray » (1 Gy= 1 J/Kg). Le détriment est mesuré en « Sievert », produit du gray avec des facteurs de pondérations : 1Sv= 1Gy x Fp. Ceci vaut pour les rayonnements particulaires comme pour les rayonnements photoniquesC’est ainsi que la « dosimétrie biologique » est née, grâce à la culture des lymphocytes, et le triage de celles-ci par cytofluorométrie (triage automatique de cellules marquées par flurescence). Il s’agit de détecter dans le caryotype puis de compter :
– Soit des lésions stables, c’est à dire capables de franchir l’étape de division cellulaire pendant un long intervalle de temps (pendant plusieurs années, avant la dilution ? des noyaux lésés). La méthode de référence est dite « d’hybridation in situ fluorescente (FISH) décrite par PINKEL en 1986 (1). Ces lésions sont pour l’essentiel des translocations.
– Soit des lésions instables, comme les délétions et surtout les chromosomes dicentriques, réputées franchir difficilement l’étape de la division cellulaire (50% des cellules avec dicentriques induisent une apoptose), d’où une décroissance rapide au cours du temps. La détection des dicentriques se fait par la recherche des métaphases cellulaires puis par double coloration du contour chromosomal puis du centromère.
Dans les faits, la technique basée sur la détection des dicentriques est la plus utilisée car cette anomalie est spécifique en tant que radio lésion, et qu’il s’agit en pratique d’évaluer les conséquences d’accidents nucléaires aigus.  fig. 1
La difficulté est la suivante : par comptage manuel sur des lymphocytes cultivés, la dosimétrie biologique a pour seuil (C’est à dire la limite inférieure significative du comptage des anomalies) 3 cGy pour 1500 cellules examinées, mais cela prend beaucoup de temps. Avec les comptages automatiques, quelque soit le système, le seuil remonte à 10 ou 20 cGy, et surtout les faux négatifs augmentent : de 30 à 50% de dicentriques ne sont pas correctement enregistrés selon Roy et al en 2003 (2). La solution proposée est aujourd’hui le comptage manuel pour les expertises individuelles par contre, en cas de catastrophe nucléaire, c’est le comptage automatique qui est privilégié, malgré les faux négatifs, car la rapidité des résultats est décisive, le comptage sur 300 cellules se faisant en moins de 30 minutes.

LES EFFETS NON CIBLES

Le développement de nouvelles techniques et surtout l’essor prodigieux de la biologie moléculaire a entraîné de nouvelles interrogations pour les radio biologistes : La prédominance absolue du noyau cellulaire en tant qu’unique réceptacle des effets des rayonnements ionisants est-elle toujours pertinente ? Les autres organites cellulaires peuvent-ils aussi jouer un rôle ? Par exemple, le tritium, émetteur ß- de court trajet, environ 0,7 µm, est considéré comme peu toxique, puisque son impact avec le noyau cellulaire est peu probable (sauf s’il est incorporé dans une molécule qui s ‘intègre dans le noyau Ex : Thymidine, et donc comme OBT). Or, l’étude du tritium organiquement lié (OBT) montre qu’il est capable d’induire une sécrétion excessive de protéine P53 vecteur majeu des apoptoses, sans lésions visibles du noyau. S’agit-il des conséquences de la rupture constatée de la paroi des mitochondries ? Finalement, existe-t-il une autre référence conceptuelle pour la radio biologie ?
C’est dans ce contexte que les « effets non ciblés » décrits par le NCRP britannique (National Council on Radioprotection) ont bouleversé la donne et ébranlé les fondements même de la radio biologie. Rappelons ici la définition de ces effets par l’UNSCEAR (United Nations Committee on the Effects of Atomic Radiation) reprise par l’IRSN (Institut de Radioprotection et de Sûreté Nucléaire en septembre 2006 (3) :  » l’appellation « effets non ciblés » regroupe des effets dont les mécanismes semblent être différents les uns des autres. Ils présentent une caractéristique commune, ils ne sont pas en rapport avec un dépôt d’énergie au niveau du noyau de la cellule, phénomène qui constituait jusqu’aux années dernières le dogme de la radio biologie classique. Il en découle que l’effet carcinogène est, d’une manière ou d’une autre, en rapport avec le potentiel mutagène et clastique (lié à l’apparition d’un gène defectueux où à l’expression excessive d’oncogènes ) ». On peut décrire ces effets en reprenant l’ancienne logique des « effets stochastiques », et envisager 3 étapes obligatoires pour ces effets :
1- Ce qui se passe au moment même de l’irradiation
2- Ce qui se transmet pendant un laps de temps ± long, et qui restait inconnu jusqu’à ce jour.
3- Ce qui apparaît in fine sous forme de pathologies plus fréquentes chez les irradiés comparés avec une population non irradiée.

ETAPE N°1:

Sans remettre en cause les effets ciblés, que se passe-t-il en plus au moment de l’irradiation ou de la contamination radio active ? La découverte fondamentale, cohérente avec les concepts de la biologie moléculaire sur le rôle des protéines et l’existence de réseaux cellulaires, c’est le  » bystander effect » ou « effet de proximité ». Il s’agit, selon la définition de l’UNSCEAR de  » l’effet de proximité décrit la capacité des cellules affectées par un agent extérieur, de transmettre les manifestations du dommage à d’autres cellules qui ne constituent pas la cible directe de l’agent causal ou qui est susceptible de l’exprimer  » (3)
Les preuves expérimentales sont nombreuses, mais l’auteur principal de ces travaux est sans conteste JOHN B. LITTLE (4). Voici un exemple convaincant réalisé par l’équipe de Little en 2001 (5).
Cette expérience n’aurait pas été possible sans la mise au point de micro faisceaux de particules  ou de rayons  capables d’irradier une ou quelques cellules.
Il s’agit d’une culture de fibroblastes humains normaux diploïdes examinée en immuno fluorescence in situ pour la détection de la protéine P 21  figure 2  :
Sur la figure de gauche, la culture de cellules non irradiée n’exprime que très peu la protéine P21. Sur la figure du centre, une irradiation très faible, 0,3 cGy, conduisent de nombreuses cellules à exprimer la P21, alors que 1 à 2% seulement de noyaux ont été traversé par une particule . Si cette culture irradiée est incubée avec du lindane, inhibiteur de la communication inter cellulaire, alors, sur la figure de droite, l’expression de la P21 redevient modeste.
De tels faits ont été aussi constaté après l’utilisation de micro faisceaux  ou par des rayons ultra violets (5)
Cette propagation du signal vers des cellules voisines non irradiées concerne au premier chef la P53 (signal majeur pour la mort programmée) mais aussi la CDC2, la cyclin B, rad 51,(protéines du même type) etc. cela conduit d’abord à l’extension de l’apoptose mais aussi à l’extension de la transmission du signal à des cellules filles devenant « fautives ».
Little inclus dans cet effet 2 autres constatations expérimentales (4) :
– L’EFFET CLASTOGENIQUE, décrit par notre collègue, Mme EMERIT (6). Il s’agit de l’induction par des substances plasmatiques de dommages chromosomiques sur des cellules ou des tissus non concernés par l’irradiation ( par exemple sur un autre individu ) . Ce mécanisme est démontré expérimentalement par l’action du plasma d’un sujet irradié sur des cultures de cellules normales. Cet effet clastogénique décrit comme une transmission de stress oxydatif intra cellulaire a pu être attribué à des interleukines circulantes, surtout l’IL 8. L’intérêt majeur de cet effet reste sa survivance à l’irradiation primitive, selon Mme EMERIT, par exemple sur les « liquidateurs » de Tchernobyl.
– L’EFFET ABSCOPAL ou effet « hors cible » a été décrit au sujet d’un patient japonais de Nagasaki. Celui-ci était atteint d’un hépatome primitif, et il avait subit une radiothérapie à visée palliative, ciblée sur une métastase osseuse. A la surprise générale, la tumeur hépatique, quoi que non irradiée, a régressé. Cet effet a pu être retrouvé toujours au Japon sur des patientes atteintes du cancer du sein, âgées de plus de 55 ans. Tout se passe comme si cet effet à distance des signaux avait pu entraîner une apoptose des cellules malignes, peut être par un facteur humoral de type TNF.( c’est une interleukine comme l’IL 8, qui joue un rôle majeur dans la croissance des tumeurs)
D’une façon générale, l’effet de proximité relance le débat sur les faibles doses : Rothman et Löbrich (7) ont obtenu après irradiation de cellules de 1 mGy, 3% de lésions du DNA, avec une répartition très hétérogène, alors que le modèle linéaire sans seuil n’autorise pas plus de 1% de lésions. L’hypothèse soulevée par les auteurs est certes un effet de proximité multiplicateur mais aussi une incrimination particulière des radicaux libres. Les auteurs ont vérifié la réalité de cet effet par la vieille technique du taux de survie des cellules irradiées à la dose de 1 mGy. Le modèle classique prévoit dans ces conditions 99% de cellules survivantes, et ils ne trouvent que 80 à 90% de survie dans leur modèle expérimental.
L’effet de proximité rend donc compte de la démultiplication des effets directs de l’irradiation , aussi bien la mort programmée que la création d’un clone de cellules fautives, mais il reste ensuite à déterminer le devenir de ces cellules fautives radio induites.

ETAPE N°2: LA TRANSMISSION

C’est pour ce processus qu’il y eut la 2ème découverte fondamentales ;
L’instabilité génomique, c’est à dire l’instabilité des chromosomes: Ce que J.B. Little a magnifiquement démontré (4), l’induction, par irradiation, d’un type d’instabilité génomique transmissible dans la descendance des cellules. Elle conduit a une augmentation persistante du taux auxquels des altérations génétiques, incluant des mutations et des aberrations chromosomiques, surviennent chez les descendantes des cellules irradiées originellement après plusieurs générations de réplication cellulaire. La figure N°3 schématise les données expérimentales de Little (4).
Toute cellule qui se divise, si elle est indemne de toute lésion chromosomique, va donner naissance a une population de descendants de même type, on dit qu’elle a un phénotype « sauvage ». S’il s’agit d’une cellule mutée après irradiation, cette mutation sera transmise à sa descendance. Le problème commence quand, ce qui est le cas le plus fréquent, des cellules irradiées réparées ou des cellules voisines, et qui ont donc un phénotype sauvage, se divisent normalement dans une première étape. Mais, au cours des divisions successives des descendants, à la 12ème voire à la 30ème génération, la fréquence des mutations s’élève brusquement au sein delà population monoclonale dérivée de cellules irradiées. On va retrouver 10% de mutations c’est à dire une augmentation significative de fréquence, comparées à un clone de cellules non irradiée.
Tout se passe comme si la réparation des lésions directes ou liées au voisinage, n’était pas stable au cours des générations successives et que la probabilité de revoir une cellule fautive augmentait au cours du temps. Cette transmission d’un signal pour la réapparition d’une aberration chromosomique ne suffit pas pour définir l’instabilité génomique. Il faut de plus y répondre à 2 questions :
– Comment cette instabilité s’inscrit-elle dans la chaîne à double sens, DNA-RNA- protéines. Par exemple, comment ces chromosomes fautifs entraînent dans les générations cellulaires futures, soit un excès soit une inhibition de production de P53, de celle-ci, et donc un vieillissement excessif des cellules, et une plus forte probabilité de cancérisation.
– Ce phénomène se déclenche-t-il sur une base totalement aléatoire ou bien est-il lié à un phénomène starter ? C’est ici que LIMOLI en 1998 (8) introduit le rôle spécifique du stress oxydatif, mais pour quelle raison, par quel mécanisme ?
Pour répondre à ces 2 questions, nous devons examiner 2 autres processus, l’instabilité des mini et des micro satellites, et la question de l’amplification du signal génétique.

L’INSTABILLITE DES MINI ET MICRO SATELLITES :
Toutes nos littératures policières ont pris comme base les nouvelles empreintes digitales, c’est à dire l’analyse de l’ADN: Grâce à celle-ci le coupable est vite trouvé, les procès en paternité promptement réglés, Sherlock Holmes ridiculisé, etc. Mais aucune ne répond à la question, pourquoi l’analyse de l’ADN démontre un extraordinaire polymorphisme des individus, alors que la génétique classique disait exactement le contraire ? La réponse est dans l’existence de nombreuses séquences répétées en tandem se suivant en double dans les génomes eucaryotes. S’agit de mini satellites (correspondant à plus de 100 paires de bases jusqu’à 500) ou de micro satellites (de 2 à 4 paires de bases). Les mini satellites sont présents tout au long du chromosomes selon RAMEL, 1997, (9) en partie autour du centromère mais chez l’homme ils sont surtout localisé aux extrémités du chromosome et vont jouer un rôle important dans la constitution des télomères pendant la mitose, et donc à leur éventuelle perturbation. Or il se trouve que l’instabilité des mini satellites est considérable, et peut atteindre 96%, ce qui expliquerait le polymorphisme des individus. Certains auteurs (9) l’appellent une « dynamite génétique ». En relation avec leur instabilité, les mini satellites sont aussi des inducteurs potentiels d’exposition aux agents génotoxiques. Une irradiation faible de 0.5 Gy induit une forte augmentation de mutations. Mme DUBROVA en 1996 (10) a démontré que le taux de mutations des mini satellites instables dans la lignée germinale était significativement augmenté chez les populations humaines vivant dans les régions contaminées après l’accident nucléaire de Tchernobyl. On comprend mieux, pour ces raisons, l’impact des anomalies du chromosome fautif, et dans le mécanisme de transmission, le taux élevé de mutations dans la descendance monoclonale. Mais quel est le lien entre ces mutations et la genèse de pathologies, par exemple la cancérisation ? La réponse est dans le phénomène dit « d’amplification génétique » au sens anglo- saxon du terme.

L’AMPLIFICATION GENETIQUE :
Il s’agit d’une réponse adaptative face à un agent exogène, où une protéine dite de régulation va activer un gène qui a son tour va entraîner la fabrication de protéines ad hoc en grande quantité. Que se passe-t-il quand le mini satellite est connecté avec un proto oncogène comme le locus HRAS1 VNTR Rappelons d’abord le rôle majeur de l’expression des oncogènes dans la genèse du cancer. Le risque est la création d’allèles liés à cet expression d’oncogènes ou simplement que le mini satellite muté dans un sens pathologique, rompt le lien avec la création de protéines protectrices et donc entraîne une plus grande fragilité du noyau à des agents génotoxiques comme les radicaux libres. Le stress oxydatif dans ce cas peut représenter le « 2ème événement déclencheur ». Il fut rappeler ici que ces allèles anormaux sont retrouvés dans 10% des cancers (9).

ETAPE N°3: LES PATHOLOGIES INDUITES :

Sans passer en revue les anciennes constatations des effets stochastiques des rayonnements ionisants comme les leucoses et les cancers, il paraît utile de soulever 2 questions non usuelles : les « 2ème cancers » et les pathologies radio induites non-cancéreuses.
LES DEUXIEMES CANCERS RADIO INDUITS:
La guérison de nombreuses tumeurs malignes, en particulier chez les sujets jeunes, a vu apparaître dans les 20 ans suivant un autre cancer non métastatique et considéré comme radio induit (suite à la radiothérapie utilisée pour le premier). Le meilleur exemple, la survenue d’un autre cancer après radiothérapie pour maladie de Hodgkin, à un âge très en dessous des normes classiques de survenue. L’instabilité génomique est considérée par les radiothérapeutes comme la meilleure explication et comme le lien fondamental entre le premier et le second événement. Ceci fait consensus et explique le rôle majeur des investigations du caryotype avant et après radiothérapie comme les efforts d’encadrement de l’utilisation des rayons dans la cure des cancers.
LES PATHOLOGIES NON-CANCEREUSES:
Ce chapitre n’est pas nouveau : par exemple la cataracte radio induite (spécifiquement par un flux de neutrons) est connue depuis 70 ans. Ce qui est nouveau, c’est l’introduction par l’UNSCEAR (3) des maladies cardiovasculaires comme radio induites et donc au-delà des effets toxiques directs de la sur irradiation du cœur, de l’ordre de 40 Gy sur le médiastin.
Plus intéressante encore est la validation des effets de la radioactivité sur le système immunitaire, au-delà des effets classiques destructeurs bien connus sur les lymphocytes B et T,. Il s’agit de la combinaison de l’irradiation et des phénomènes antigéniques qui conduisent à une réponse auto immune. Exemple, l’existence élevée d’hyperthyroïdie de type Basedow ou de thyréose d’Hashimoto, après irradiation fortuite de la thyroïde, ou chez les « liquidateurs » de Tchernobyl. Mon élève Khalil. BOURAHLA, en a trouvé, dans environ 10% des irradiations du thorax pour tumeur médiastinale, malgré la mise en place d’une coque sur la glande thyroïde. Ces maladies auto immunes radio induites sont explicables par l’effet de proximité et l’instabilité génomique, mais aussi par l’hypothèse d’une baisse significative des capacités de l’ensemble des paramètres impliqués dans la réponse immunitaire (3)
On ne peut pas dire en conclusion de ce survol sur la nouvelle radio biologie ( il y a plus de mille publications à ce sujet) qu’il y a aujourd’hui toutes les réponses au mystère de la radio induction pathologique. Il y a encore beaucoup de recherches à faire dans le domaine de la promotion des cancers par des toxiques chimiques, le tabac, etc. Nous avons encore beaucoup à apprendre sur les similitudes ou les différences avec les autres agents cancérigènes. De même, en biologie moléculaire, il y a aussi à apprendre sur le rôle des organites cellulaires, sur la réversion de la chaîne dans le sens protéines-RNA-DNA, sur la compétition entre l’apoptose et la création incessante d’anomalies du chromosome. Mais le bouillonnement actuel en radio biologie mérite qu’on s’y arrête et qu’on y réfléchisse sur un mode pluri disciplinaire.

BIBLIOGRAPHIE:

1- PINKEL D, STRAUME T, GRAY JW. Cytogenetics analysis using quantitative high sensibility fluorescence hybridisation . Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 2934-2938, 1986.
2- ROY L, DELBOS M, PAILLOLE N, DURAND V, VOISIN P. comparaison de système d’analyse d’images cytologiques en dosimétrie radio biologiques Radioprotection, 38, 323-340, 2003.
3- NENOT JC, SUGIER A. Synthèse par l’IRSN des rapports de l’UNSCEAR période de 2003-2007. IRSN Doc. Références 2006/74,7/44, 2006.
4- LITTLE JB. Genomic instability and bystander effects: a historical perspective. Oncogene, 22 ,6978-6987, 2003.
5- DAHLE J, KVAM E, STOKKE T. Bystander effects in UV-induced genomic instability. Anti oxidants inhibit delayed mutagenesis induced by ultra-violet A and B radiation. J.Carcinogenesis. 4,11,2005
6- EMERIT I. Detection of clastogenic factors in oxidative stress- associations diseases. Use fullness of this assay for evaluation of anti-oxidants CEJOEM, 4,3-10, 1998;
7- ROTHKAMM K, LÔBRICH M. Evidence for a lack of DNA double-strand repair in human cells exposed to very low X-ray doses. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100,5057-5062, 2003
8- LIMOLI CL, KAPLAN MI, GIEDZINSKI E, MORGAN WF. Attenuation of radiation-induced genomic instability by high and low LET ionising radiation. A; Dv. Space Ris.25, 2107-2117, 2001
9- RAMEL L. Mini and micro satellites; Env; He. Persp. 105, 4, 781-789, 1997
10- DUBROVA YE, NESTOROV VN, KROUCHINSKY NG. Human mini satellites mutation after Chernobyl accident. Nature, 380, 683-686,1996

LEGENDES:

FIGURE N°1, Caryotypes.
A : normal ; B : lymphocytes irradiés, lésions instables.

FIGURE N°2 : Effet de proximité.
Sur la figure de gauche, la culture de cellules non irradiée n’exprime que très peu la protéine P21. Sur la figure du centre, une irradiation très faible, 0,3 cGy, conduisent de nombreuses cellules à exprimer la P21, alors que 1 à 2% seulement de noyaux ont été traversé par une particule . Si cette culture irradiée est incubée avec du lindane, inhibiteur de la communication inter cellulaire, alors, sur la figure de droite, l’expression de la P21 redevient modeste. (LITTLE)

Question posée lors de la séance du samedi 29 mars 2008
à M. le Prof. A. BEHAR

M. J.E. Dumont. – Je félicite M. Behar pour cet exposé synthétique. En prolongement de ce qu’il vous a exposé, je voudrais souligner : 1) H202 et ROS sont à la fois des sous-produits de métabolisme, des signaux intracellulaires et des substrats dans les cellules comme la cellule thyroïdienne et le leucocyte. Les gammes de concentrations impliquées vont de 0,1 à 100 micromolaires. Toute fuite d’un compartiment ou toute augmentation de production, par exemple suite à des mutations ou des activations peut contribuer à des altérations de l’ADN ; 2) un chercheur de notre laboratoire, M. V. Detours, a montré qu’en utilisant la signature d’expression génique de cellules irradiées et de cellules traitées par H202 in vitro, il parvient à distinguer des carcinomes papillaires des pays occidentaux et les carcinomes de Tchernobyl. Cette signature est probablement une signature de sensibilité.